迈尔斯·莫拉莱斯(沙梅克·摩尔 配)的生活因为一次意外变得复杂。他被一只放射性蜘蛛咬伤,并因此获得了毒液冲击、伪装隐藏、蜘蛛爬行、超凡听力、蜘蛛感应等一系列超能力。与此同时,这座城市里最臭名昭著的犯罪头目金并(列维·施瑞博尔 配)已经建立起一台高度隐秘的超级对撞机,这台对撞机开启了通往其他宇宙的时空通道,来自其他宇宙、不同版本的蜘蛛侠也来到了迈尔斯所在的世界。迈尔斯和从其它平行宇宙中穿越而来的蜘蛛侠彼得·B·帕克(杰克·M·约翰森 配)、女蜘蛛侠格温·史黛西(海莉·斯坦菲尔德 配)、暗影蜘蛛侠(尼古拉斯·凯奇 配)、日系少女蜘蛛侠潘妮·帕克(贵美子·格伦 配)和蜘猪侠(约翰·木兰尼 配)六位蜘蛛侠首次集结成团,共同对抗蜘蛛侠宇宙最强反派